限制酶（英语：restriction enzyme）又称限制内切酶或限制性内切酶（restriction endonuclease），全称限制性核酸内切酶，是一种能将双股DNA切开的酶。切割方法是将糖类分子与磷酸之间的键结切断，进而于两条DNA链上各产生一个切口，且不破坏核苷酸与碱基。切割形式有两种，分别是可产生具有突出单股DNA的黏状末端，以及末端平整无凸起的平滑末端。。由于断开的DNA片段可由另一种称为DNA连接酶的酵素黏合，因此染色体或DNA上不同的限制片段，得以经由剪接作用而结合在一起。
限制酶在分子生物学与遗传工程领域有广泛的应用，此类酵素最早发现于某些品系的大肠杆菌体内，这些品系能够“限制”噬菌体对其感染，因此得名。科学家认为限制酶是细菌所演化出来对抗病毒感染，并帮助将已殖入的病毒序列移除的机制。是限制修饰系统（restriction modification system）的一部分。约翰霍普金斯大学的丹尼尔·那森斯、汉弥尔顿·史密斯与伯克利加州大学的沃...
